Главный персонаж - Коммандер Шепард — первый человек, удостоившейся носить звание Спектра. Спектры — это элитные подразделения, существа на которых держится Совет Цитадели, его правая рука.
Спектров не готовят, а выбирают из лучших. Спектры — символ Цитадели. Как полевой агент, Шепард имеет полномочия завершать свои задания любым способом. В начале игры, игрок может выбирать внешний облик, пол, предысторию и класс персонажа. В зависимости от выбранной истории меняется ход событий, манера поведения персонажа.
Mass Effect — первая игра с полностью озвучеными диалогами, поэтому можно выбрать только имя персонажа, фамилия останется без изменений.
Члены команды:
Эшли Уильямс — человек-солдат. Игрок-мужчина может завести с ней роман.
Лиара Т’Сони — компаньон-асари, любящий изучать и работать с протеанскими технологиями. Игрок любого пола может завести роман с Лиарой (асари асексуальны).
Кайден Аленко — человек, помощник Шепарда. Игрок-женщина может завести с ним роман.
Гаррус Вакариан — турианин, бывший агент Безопасности Цитадели, ушедший в отставку после разочарования в слишком «законных» методах организации.
Урднот Рекс — один из последних кроганов ранга Боевой Мастер. Эти редкие индивиды могут совмещать биотические способности с продвинутыми технологиями. Несмотря на свой угрожающий вид, Врекс редко теряет самообладание. Он также предпочитает много не говорить.
Тали’Зора нар Райя — молодая кварианка, которая во время ритуального Паломничества обнаружила доказательство предательства Сарена. Как и все квариане, Тали отлично разбирается в любой технике.
Союзники:
Капитан Дэвид Андерсон — командин корабля «Нормандия» и главный персонаж романа-приквела «Mass Effect: Открытие», в котором он встретился с Сареном. Близкий наставник Шепарда и его советник. После зачисления Шепарда в ряды Спектров, добровольно передаёт ему/ей командование «Нормандией» (Спектр держит ответ лишь перед Советом Цитадели). Озвучен Китом Дэвидом.
Джефф «Джокер» Моро — пилот «Нормандии». Несмотря на свою врожденную хрупкость, является лучшим пилотом Альянса. Озвучен Сетом Грином.
Навигатор Прессли — заместитель Шепарда на борту «Нормандии». Прессли не по душе присутствие нелюдей на передовом корабле Альянса.
Капрал Л. Дженкинс — солдат родом с Эдема Прайм. Очень агрессивен и любит подраться.
Найлус Крыйк — известный Спектр-турианин. Сарен был его наставником. Нихлус отлично умеет пользоваться слабостями врага и всегда остаётся хладнокровным, хотя его методы далеки от жестокости Сарена.
Шиала — союзник-асари которую многие считают Оракулом.
Адмирал Хаккетт — командующий Пятым космическим флотом Альянса из своей штаб-квартиры на Земле. В игре не виден, но несколько раз посылает Шепарду сообщения. Озвучен Лэнсом Хенриксеном.
Враги:
Сарен Артериус — сбежавший Спектр-турианин. Известен своими жестокими методами добычи информации. Глубоко ненавидит людей, возможно из-за гибели брата в войне Первого Контакта. После событий романа-приквела, Сарен подчиняет себе армии гетов. Он является основным злодеем игры.
Бенезия — асари-матриарх в союзе с Сареном. Мать Лиары. Голос Марины Сиртис.